Перший православний храм в Кілії — Святого Іоанна — був побудований візантійцями ще в 11-му столітті (1077 г). За часів правління молдавського господаря Стефана Великого на цьому місці був споруджений (1464-1479) великий храм Святого Миколая, який, ймовірно, зруйнували турки-османи. На його місці в 1485-1489 роках молдавани побудували напівпідземний храм Святого Миколая, який зберігся до нашого часу. В Османській імперії немусульманські храми будувати дозволяли, але не вище 2,5 метрів (за однією версією, щоб вони не перевищували висоту турецького вершника верхи на коні зі списом, за іншою — щоб не височіли над турецькими мечетями). Тому велика частина будівлі православної церкви розташовувалася під землею.

Висвітлювалася церква тільки свічками, в результаті стіни були покриті товстим шаром кіптяви, що дозволило в збережених церквах при реставрації відновити розписи того часу.

Церква перебудовувалася в 1640-і роки на кошти молдавського господаря Василя Лупула — тестя Богдана Хмельницького. Храм був прикрашений всередині і зовні білим мармуром, привезеним з Греції. Дзвіницю в стилі необароко побудували значно пізніше — в 1891 році.

За радянських часів храм був закритий, його використовували як вугільний склад, а потім і зовсім закинули, перетворивши на сміттєзвалище. Мармурове облицьовування зняли. Церковний дзвін використовували на місцевому поромі. У 1992 році храм відновили і служби були відновлені — тут знову співають півчі, а підлоги вистелені килимами за старою молдавською традицією.